Sangerowanie sekwencyjne i generowanie myszy cz. 2

width=300Aby zminimalizować ryzyko efektów pozaplanowych spowodowanych przez CRISPR-Cas9, zastosowano następujące strategie. (1) Użyto gRNA z wysokim wynikiem 85. Im wyższy wynik, tym mniejsze prawdopodobieństwo efektów ubocznych. (2) Wygenerowano cztery myszy F0, mianowicie F2, M3, M21 i F22. Spośród tych czterech myszy F0, samce M3 i M21 były jałowe. Dwie pozostałe samice F0 (F2 i F22) zostały następnie użyte jako twórcy dwóch niezależnych szczepów i krzyżowane wstecznie z myszami typu dzikiego (WT) przez dwie generacje, aby wyprodukować potomstwo NF2 skrzyżowane w celu wytworzenia Xrcc2L14P / L14P, Xrcc2L14P / WT lub Xrcc2WT / Myszy WT. (3) Przekazano mutację Xrcc2-c.41T> C u myszy przez sześć pokoleń i odkryliśmy, że fenotyp azoospermii jest segregowany z genotypem homozygoty w dwóch liniach myszy Xrcc2-KI (F2 i F22), odpowiednio.

Wszystkie protokoły badań na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Eksperymentu Zwierząt w Hunan Childrens Hospital (Changsha, Chiny). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi i przepisami.

Sangerowanie sekwencyjne i generowanie myszy cz. 1

width=288Sekwencjonowanie Sanger przeprowadzono na analizatorze genetycznym ABI-A3500 i zastosowano zestaw do sekwencjonowania BigDye 3.1 (Applied Biosystems, California, USA).

Model myszy C57BL / 6 z mutacją punktową (około 41 T> C) w locus Xrcc2 wygenerowano przez mikroiniekcję CRISPR / Cas9 do zapłodnionych komórek jajowych (Cyagen, Chiny). Mysi gen Xrcc2 (numer dostępu w GenBank: NM_020570.2; Ensembl: ENSMUSG00000028933) był zlokalizowany na chromosomie 5qB1. Podstawową mutację c.T41 w dawcy oligo wprowadzono do eksonu 2 przez naprawę ukierunkowaną na homologię. MRNA Cas9, gRNA i dawca oligo zostały wspólnie wstrzyknięte do zygot dla produkcji myszy KI. Szczenięta genotypowano za pomocą PCR i sekwencjonowania Sangera przy użyciu genomowego DNA lub cDNA jako matrycy.
[hasła pokrewne: kreatynina egfr, krótkie wędzidełko napletka, kuzynka brzozy ]

Sekwencjonowanie

width=300Sekwencjonowanie przeprowadzono dla czterech członków rodziny. W skrócie, genomowy DNA (około 1,5 ug) dla każdego członka poddano fragmentacji do średniej wielkości 350 bp i poddano tworzeniu biblioteki DNA stosując ustalone protokoły Illumina. Biblioteki przyłączone do ligandu amplifikowano i zindeksowano za pomocą PCR. Następnie bibliotekę hybrydyzowano z biblioteką NimbleGen SeqCap EZ Exome Capture Kit (44M, Roche, Madison, USA) i masowo równoległym sekwencjonowaniem w 90-zasadnych parach przeprowadzono na Illuminie HiSeq 2000, zgodnie z protokołami producenta. Odczyt mapowania i analizy wariantów jest następujący. Surowe odczyty o niskiej jakości lub zawierające adaptery zostały odfiltrowane przed mapowaniem. W przypadku wywoływania SNP odfiltrowane odczyty zostały dostosowane do referencji ludzkiego genomu (UCSC hg19) za pomocą pakietu Short Oligonucleotide Analysis Package (SOAP, V.2.21), a następnie do analizy SNP zastosowano oprogramowanie SOAPsnp (V.1.05). Wyeliminowano SNP o niskiej jakości z oceną jakości genotypu mniejszą niż 20 lub głębokość sekwencjonowania była mniejsza niż 4. W przypadku wywołania indel, do wyrównania użyto Burrows-Wheeler Aligner. Zduplikowane odczyty zostały oznaczone przy użyciu zestawu narzędzi Picard, a zestaw Genome Analysis Tool Kit (GATK) został użyty do wywołania małych indeli.
[podobne: konizacja chirurgiczna szyjki macicy, koronografia ryzyko, kostniak leczenie ]

Izolacja DNA i mapowanie homozygotyczne

width=300Próbki krwi obwodowej do ekstrakcji DNA uzyskano od 18 członków rodziny.

Genotypowanie całego genomu sześciu członków rodziny zostało przeprowadzone w celu zidentyfikowania obecności homozygotyczności (ROH) . W skrócie, 250 ng genomowego DNA na próbkę przetwarzano na szalkach Illumina Human Omni ZhongHua-8 Beadchip (Illumina, San Diego, Kalifornia, USA) zgodnie ze standardowym protokołem. Znormalizowane wyniki zostały wygenerowane przy użyciu Genome Studio V.2011.1 (Illumina). Oprogramowanie PLINK zostało użyte do wyszukania regionów ROH zgodnie z ustalonymi kryteriami.
[więcej w: klątwa ondyny choroba, kłykciny kończyste sromu, kompulsywne objadanie ]

Bettelheim: Życie i dziedzictwo

Fotografia Bruno Bettelheima na okładce tej nowej i mistrzowskiej biografii zawiera wiele potężnych i sprzecznych obrazów, które przyszły określić tego skomplikowanego człowieka. Siedzi, czytając przed kunsztownym kandelabrem, starszego mężczyznę z wyrazem takiej głębi, że można w nim znaleźć mądrość, znużenie, pogardę, niecierpliwość, ciepło, a przede wszystkim bezpośrednią intensywność. To właśnie autorka, Nina Sutton, urodzona w Wielkiej Brytanii francuska dziennikarka, opowiedziała historię Bettelheima w taki sposób, aby umożliwić ekscytującą eksplorację życia tego niezwykłego człowieka. Bruno Bettelheim jest prawdopodobnie najbardziej znany w tym kraju jako dyrektor Szkoły Orthogennej, szkoły dla dzieci poważnie zaburzonych, związanych z University of Chicago. W latach pięćdziesiątych i sześćdziesiątych ta szkoła zyskała sławę wraz z jej dyrektorem za pionierski sposób wykorzystania intensywnej terapii opartej na zasadach psychoanalitycznych w celu leczenia poważnych zaburzeń psychicznych w dzieciństwie. Read more „Bettelheim: Życie i dziedzictwo”