Sangerowanie sekwencyjne i generowanie myszy cz. 2

width=300Aby zminimalizować ryzyko efektów pozaplanowych spowodowanych przez CRISPR-Cas9, zastosowano następujące strategie. (1) Użyto gRNA z wysokim wynikiem 85. Im wyższy wynik, tym mniejsze prawdopodobieństwo efektów ubocznych. (2) Wygenerowano cztery myszy F0, mianowicie F2, M3, M21 i F22. Spośród tych czterech myszy F0, samce M3 i M21 były jałowe. Dwie pozostałe samice F0 (F2 i F22) zostały następnie użyte jako twórcy dwóch niezależnych szczepów i krzyżowane wstecznie z myszami typu dzikiego (WT) przez dwie generacje, aby wyprodukować potomstwo NF2 skrzyżowane w celu wytworzenia Xrcc2L14P / L14P, Xrcc2L14P / WT lub Xrcc2WT / Myszy WT. (3) Przekazano mutację Xrcc2-c.41T> C u myszy przez sześć pokoleń i odkryliśmy, że fenotyp azoospermii jest segregowany z genotypem homozygoty w dwóch liniach myszy Xrcc2-KI (F2 i F22), odpowiednio.

Wszystkie protokoły badań na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Eksperymentu Zwierząt w Hunan Childrens Hospital (Changsha, Chiny). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi i przepisami.

Sangerowanie sekwencyjne i generowanie myszy cz. 1

width=288Sekwencjonowanie Sanger przeprowadzono na analizatorze genetycznym ABI-A3500 i zastosowano zestaw do sekwencjonowania BigDye 3.1 (Applied Biosystems, California, USA).

Model myszy C57BL / 6 z mutacją punktową (około 41 T> C) w locus Xrcc2 wygenerowano przez mikroiniekcję CRISPR / Cas9 do zapłodnionych komórek jajowych (Cyagen, Chiny). Mysi gen Xrcc2 (numer dostępu w GenBank: NM_020570.2; Ensembl: ENSMUSG00000028933) był zlokalizowany na chromosomie 5qB1. Podstawową mutację c.T41 w dawcy oligo wprowadzono do eksonu 2 przez naprawę ukierunkowaną na homologię. MRNA Cas9, gRNA i dawca oligo zostały wspólnie wstrzyknięte do zygot dla produkcji myszy KI. Szczenięta genotypowano za pomocą PCR i sekwencjonowania Sangera przy użyciu genomowego DNA lub cDNA jako matrycy.
[hasła pokrewne: kreatynina egfr, lordoza lędźwiowa, kuzynka brzozy ]

Sekwencjonowanie

width=300Sekwencjonowanie przeprowadzono dla czterech członków rodziny. W skrócie, genomowy DNA (około 1,5 ug) dla każdego członka poddano fragmentacji do średniej wielkości 350 bp i poddano tworzeniu biblioteki DNA stosując ustalone protokoły Illumina. Biblioteki przyłączone do ligandu amplifikowano i zindeksowano za pomocą PCR. Następnie bibliotekę hybrydyzowano z biblioteką NimbleGen SeqCap EZ Exome Capture Kit (44M, Roche, Madison, USA) i masowo równoległym sekwencjonowaniem w 90-zasadnych parach przeprowadzono na Illuminie HiSeq 2000, zgodnie z protokołami producenta. Odczyt mapowania i analizy wariantów jest następujący. Surowe odczyty o niskiej jakości lub zawierające adaptery zostały odfiltrowane przed mapowaniem. W przypadku wywoływania SNP odfiltrowane odczyty zostały dostosowane do referencji ludzkiego genomu (UCSC hg19) za pomocą pakietu Short Oligonucleotide Analysis Package (SOAP, V.2.21), a następnie do analizy SNP zastosowano oprogramowanie SOAPsnp (V.1.05). Wyeliminowano SNP o niskiej jakości z oceną jakości genotypu mniejszą niż 20 lub głębokość sekwencjonowania była mniejsza niż 4. W przypadku wywołania indel, do wyrównania użyto Burrows-Wheeler Aligner. Zduplikowane odczyty zostały oznaczone przy użyciu zestawu narzędzi Picard, a zestaw Genome Analysis Tool Kit (GATK) został użyty do wywołania małych indeli.
[podobne: konizacja chirurgiczna szyjki macicy, koronografia ryzyko, kostniak leczenie ]

Izolacja DNA i mapowanie homozygotyczne

width=300Próbki krwi obwodowej do ekstrakcji DNA uzyskano od 18 członków rodziny.

Genotypowanie całego genomu sześciu członków rodziny zostało przeprowadzone w celu zidentyfikowania obecności homozygotyczności (ROH) . W skrócie, 250 ng genomowego DNA na próbkę przetwarzano na szalkach Illumina Human Omni ZhongHua-8 Beadchip (Illumina, San Diego, Kalifornia, USA) zgodnie ze standardowym protokołem. Znormalizowane wyniki zostały wygenerowane przy użyciu Genome Studio V.2011.1 (Illumina). Oprogramowanie PLINK zostało użyte do wyszukania regionów ROH zgodnie z ustalonymi kryteriami.
[więcej w: klątwa ondyny choroba, kłykciny kończyste sromu, wędzidełko napletka ]

Bettelheim: Życie i dziedzictwo

Fotografia Bruno Bettelheima na okładce tej nowej i mistrzowskiej biografii zawiera wiele potężnych i sprzecznych obrazów, które przyszły określić tego skomplikowanego człowieka. Siedzi, czytając przed kunsztownym kandelabrem, starszego mężczyznę z wyrazem takiej głębi, że można w nim znaleźć mądrość, znużenie, pogardę, niecierpliwość, ciepło, a przede wszystkim bezpośrednią intensywność. To właśnie autorka, Nina Sutton, urodzona w Wielkiej Brytanii francuska dziennikarka, opowiedziała historię Bettelheima w taki sposób, aby umożliwić ekscytującą eksplorację życia tego niezwykłego człowieka. Bruno Bettelheim jest prawdopodobnie najbardziej znany w tym kraju jako dyrektor Szkoły Orthogennej, szkoły dla dzieci poważnie zaburzonych, związanych z University of Chicago. W latach pięćdziesiątych i sześćdziesiątych ta szkoła zyskała sławę wraz z jej dyrektorem za pionierski sposób wykorzystania intensywnej terapii opartej na zasadach psychoanalitycznych w celu leczenia poważnych zaburzeń psychicznych w dzieciństwie. Read more „Bettelheim: Życie i dziedzictwo”

Bettelheim: Życie i dziedzictwo ad

Te paradoksy są opowieścią o książce i choć czasami czytelnik zostanie wyciągnięty przez Sutton na jeden biegun wielkiej sympatii i podziwu, a następnie poczuje się niegrzecznie wyalienowany przez arogancję Bettelheima i oczywiste wady, ostatecznie także czytelnik prawdopodobnie wynurzać się z czymś podobnym do autorytatywnego dążenia do utrzymania i tolerowania tych skrajności, niekoniecznie do ich syntetyzowania. Bettelheim urodził się w Wiedniu w 1903 roku. Żyd urodzony w wysoce zasymilowanej rodzinie, doświadczył jednak surowych i zakorzenionych form antysemityzmu, który przeniknął Wiedeń. We wczesnych rozdziałach Sutton przedstawia cudownie bogaty obraz życia intelektualnego Wiednia przed I wojną światową i podczas II Wojny Światowej. Bettelheim miał samotne i nieszczęśliwe dzieciństwo, utrudnione przez depresje i długi fizyczny upadek ojca z powodu syfilisu. Read more „Bettelheim: Życie i dziedzictwo ad”

Bettelheim: Życie i dziedzictwo

Fotografia Bruno Bettelheima na okładce tej nowej i mistrzowskiej biografii zawiera wiele potężnych i sprzecznych obrazów, które przyszły określić tego skomplikowanego człowieka. Siedzi, czytając przed kunsztownym kandelabrem, starszego mężczyznę z wyrazem takiej głębi, że można w nim znaleźć mądrość, znużenie, pogardę, niecierpliwość, ciepło, a przede wszystkim bezpośrednią intensywność. To właśnie autorka, Nina Sutton, urodzona w Wielkiej Brytanii francuska dziennikarka, opowiedziała historię Bettelheima w taki sposób, aby umożliwić ekscytującą eksplorację życia tego niezwykłego człowieka. Bruno Bettelheim jest prawdopodobnie najbardziej znany w tym kraju jako dyrektor Szkoły Orthogennej, szkoły dla dzieci poważnie zaburzonych, związanych z University of Chicago. W latach pięćdziesiątych i sześćdziesiątych ta szkoła zyskała sławę wraz z jej dyrektorem za pionierski sposób wykorzystania intensywnej terapii opartej na zasadach psychoanalitycznych w celu leczenia poważnych zaburzeń psychicznych w dzieciństwie. Read more „Bettelheim: Życie i dziedzictwo”

Choroba miażdżycowa łuku aorty jako czynnik ryzyka nawrotowego udaru niedokrwiennego

Doskonały artykuł opracowany przez Francuskie Badanie Płyt Aortycznych w Grupie Udarowej (wydanie z 9 maja) pokazuje, że obecność dużych krętków w bliższej aorcie, już wiadomo, że jest niezależnym czynnikiem ryzyka pierwszego udaru niedokrwiennego u osób starszych, jest również niezależny czynnik ryzyka nawrotu udaru lub peryferyjnych zdarzeń zatorowych. Co więcej, ryzyko zatorowości wzrasta wraz z grubością miażdżycy. Autorzy nie podają danych dotyczących ryzyka związanego ze złożonymi kancerogenami – czyli tymi z owrzodzeniami lub ruchomymi komponentami.
Z naszego doświadczenia wynika, że miażdżyca z owrzodzeniami wykrywanymi przez echokardiografię przezprzełykową (o szerokości i głębokości> 2 mm) lub z nałożonymi ruchomymi komponentami wiąże się z kryptogennym udarem niedokrwiennym u osób starszych. Wśród 66 pacjentów w wieku co najmniej 60 lat, u których wystąpił ostry udar niedokrwienny i u 78 osób bez grupy kontrolnej o podobnym wieku, 2 stwierdziliśmy istotnie wyższą częstość występowania proksymalnych miażdżycy aortalnej w podgrupie pacjentów z udarem kryptogennym niż w grupie kontrolnej (22 procent vs. Read more „Choroba miażdżycowa łuku aorty jako czynnik ryzyka nawrotowego udaru niedokrwiennego”

Choroba miażdżycowa łuku aorty jako czynnik ryzyka nawrotowego udaru niedokrwiennego

Doskonały artykuł opracowany przez Francuskie Badanie Płyt Aortycznych w Grupie Udarowej (wydanie z 9 maja) pokazuje, że obecność dużych krętków w bliższej aorcie, już wiadomo, że jest niezależnym czynnikiem ryzyka pierwszego udaru niedokrwiennego u osób starszych, jest również niezależny czynnik ryzyka nawrotu udaru lub peryferyjnych zdarzeń zatorowych. Co więcej, ryzyko zatorowości wzrasta wraz z grubością miażdżycy. Autorzy nie podają danych dotyczących ryzyka związanego ze złożonymi kancerogenami – czyli tymi z owrzodzeniami lub ruchomymi komponentami.
Z naszego doświadczenia wynika, że miażdżyca z owrzodzeniami wykrywanymi przez echokardiografię przezprzełykową (o szerokości i głębokości> 2 mm) lub z nałożonymi ruchomymi komponentami wiąże się z kryptogennym udarem niedokrwiennym u osób starszych. Wśród 66 pacjentów w wieku co najmniej 60 lat, u których wystąpił ostry udar niedokrwienny i u 78 osób bez grupy kontrolnej o podobnym wieku, 2 stwierdziliśmy istotnie wyższą częstość występowania proksymalnych miażdżycy aortalnej w podgrupie pacjentów z udarem kryptogennym niż w grupie kontrolnej (22 procent vs. Read more „Choroba miażdżycowa łuku aorty jako czynnik ryzyka nawrotowego udaru niedokrwiennego”

Kwas polipropylenowy w raku wątrobowokomórkowym

Uważamy, że potrzeba więcej danych zanim kwas poliprenowy może zostać zaakceptowany jako skuteczny lek do adiuwantowego leczenia raka wątrobowokomórkowego, jak donosi Muto i in. (Wydanie z 13 czerwca) .1 Jesteśmy zaniepokojeni kilkoma kwestiami poruszonymi w sprawozdaniu. Autorzy twierdzili, że nowotwory powracają do 27% grupy z kwasem poliprenowym (12 z 44) i 49% z grupy placebo (22 z 45, P = 0,04). Jednak analiza Kaplana-Meiera na rycinie 2 artykułu pokazuje łącznie 24 pacjentów (16 w grupie kwasu poliprenowego i 8 w grupie placebo), którzy byli obserwowani przez mniej niż 24 miesiące. Wśród 24 pacjentów, 11 w grupie kwasu poliprenowego i 5 w grupie placebo miało okres obserwacji krótszy niż siedem miesięcy. Read more „Kwas polipropylenowy w raku wątrobowokomórkowym”